Pentakaktivan virus

Proses pentakaktivan virus atau inaktivasi virus adalah proses yang membuat virus kehilangan kemampuannya untuk menyebabkan infeksi. Proses ini memegang peranan penting di berbagai bidang, termasuk kedokteran klinis, diagnostik, penelitian, dan industri pangan.

Dalam praktik klinis, inaktivasi virus sangat penting untuk mencegah penularan virus melalui produk darah, seperti darah untuk transfusi dan bahan biologis lainnya, serta dalam proses produksi biofarmasi.^[1] Dalam bidang diagnostik dan penelitian, inaktivasi memungkinkan virus dipelajari dan dimanipulasi secara aman tanpa menimbulkan risiko penularan kepada staf laboratorium dan tenaga kesehatan. Selain itu, dalam pengembangan vaksin, virus yang telah diinaktivasi digunakan untuk merangsang sistem kekebalan tubuh agar menghasilkan antibodi penetral, sehingga mampu menghambat infeksi virus.^[2]

Berbagai teknik inaktivasi virus telah dikembangkan, mulai dari penghilangan virus secara fisik melalui penyaringan hingga metode mekanis dan kimiawi. Pemilihan teknik yang digunakan bergantung pada konteks dan tujuan penerapannya. Dalam banyak situasi, beberapa metode diterapkan secara bersamaan, terutama ketika menangani virus yang sangat patogen, karena kondisi yang benar-benar steril menjadi persyaratan utama.

Beberapa virus yang paling umum dihilangkan melalui metode-metode tersebut antara lain HIV-1 dan HIV-2, virus hepatitis A, B, dan C, serta parvovirus.^[3]

Proses menyeluruh ini, yang kemudian lebih dikenal dengan sebutan penghilangan virus (virus removal), merupakan proses untuk menghilangkan seluruh virus yang terdapat dalam suatu sampel melalui metode ekstraksi tradisional atau metode energi penuh (full energy methods). Beberapa metode yang paling umum digunakan meliputi nanofiltrasi dan kromatografi.

Proses-proses ekstraksi tersebut digolongkan sebagai proses tradisional karena tidak memengaruhi virus secara kimiawi. Metode ini hanya menghilangkan virus secara fisik dari sampel.

Proses penghilangan virus menggunakan teknik nanofiltrasi akan menghilangkan virus berdasarkan prinsip eksklusi ukuran, yaitu hanya partikel yang berukuran lebih kecil daripada pori-pori membran yang dapat melewatinya. Teknik ini umumnya digunakan untuk menghilangkan parvovirus dan virus lain yang memiliki selubung protein (protein coat).

Sebagai gambaran, virus HIV umumnya berdiameter sekitar 180 nm (0,00018 mm), sedangkan parvovirus hanya berukuran sekitar 15–24 nm (1,5×10⁻⁵–2,4×10⁻⁵ mm), sehingga tergolong sangat kecil. Salah satu keunggulan utama metode filtrasi dibandingkan metode yang memanfaatkan suhu atau tingkat keasaman yang ekstrem adalah bahwa filtrasi tidak menyebabkan denaturasi (perubahan struktur alami) protein di dalam sampel.

Nanofiltrasi juga efektif digunakan untuk sebagian besar jenis protein. Karena metode ini tidak bergantung pada sifat kimia permukaan virus, melainkan semata-mata pada ukurannya, proses penghilangan virus dengan nanofiltrasi tetap efektif apa pun komposisi kimia permukaan partikel virus tersebut. Keunggulan lain dari teknik ini adalah kemudahannya untuk diterapkan pada skala laboratorium, kemudian ditingkatkan secara efektif hingga memenuhi kebutuhan produksi industri.

Meskipun demikian, terdapat beberapa hal yang perlu diperhatikan. Tingkat keberhasilan penghilangan virus sangat bergantung pada ukuran pori-pori nanofilter yang digunakan. Dalam beberapa kasus, virus yang berukuran sangat kecil dapat lolos melewati filter. Selain itu, variasi tekanan dan laju aliran selama proses filtrasi juga dapat memengaruhi hasil penyaringan.

Beberapa jenis filter yang digunakan dalam proses ini antara lain Planova 15N, Planova 20N, BioEX, VAG-300, Viresolve 180, Viresolve 70TM, serta berbagai produk dalam seri Virosart.

Metode kromatografi untuk menghilangkan virus sangat efektif dalam memurnikan protein dan juga mampu menghilangkan berbagai jenis virus. Namun, tingkat keberhasilannya sangat bergantung pada komposisi kolom kromatografi serta reagen yang digunakan selama proses berlangsung. Efektivitas metode ini dapat berbeda-beda untuk setiap jenis virus, dan efisiensinya juga dapat berubah bergantung pada jenis larutan penyangga (buffer) yang digunakan. Selain itu, sanitasi peralatan di antara setiap kelompok produksi juga menjadi aspek penting yang harus diperhatikan saat menjalankan prosedur ini.

Saat ini, kromatografi membran semakin banyak digunakan sebagai metode untuk pemurnian sekaligus penghilangan virus.

Dalam berbagai kegiatan yang melibatkan penelitian atau manipulasi virus, apa pun tujuan penerapannya, umumnya diperlukan tahap awal berupa pentakaktivan virus. Tujuan utamanya adalah membuat virus menjadi aman dan tidak lagi bersifat infeksius, sembari tetap mempertahankan integritas strukturnya pada tingkat yang memadai agar analisis ilmiah tetap dapat dilakukan secara bermakna.^[2]

Dalam penelitian serologi, pelestarian epitop permukaan sangat penting karena struktur yang menonjol tersebut berperan sebagai tempat melekatnya antibodi. Antigenisitas juga menjadi faktor yang sangat penting dalam pengembangan vaksin, sebab efektivitas vaksin bergantung pada kemampuannya memicu respons imun yang kuat, terutama pembentukan antibodi penetral yang mampu menghambat infeksi virus.^[2]

Sebaliknya, dalam penelitian molekuler, prioritas utamanya adalah mempertahankan materi genetik virus, seperti RNA atau DNA, dibandingkan mempertahankan struktur permukaannya. Persyaratan ini menjadi dasar bagi berbagai metode diagnostik mikrobiologi, termasuk PCR, teknik amplifikasi asam nukleat lainnya, dan pengurutan genom (sequencing).

Pentakaktivan virus dapat dilakukan melalui metode fisik maupun kimiawi, dan dalam banyak kasus kedua pendekatan tersebut digunakan secara bersamaan. Hal ini terutama diperlukan ketika menangani virus yang sangat patogen (virus dengan kemampuan tinggi menyebabkan penyakit), karena kondisi yang benar-benar steril sangat penting untuk menghilangkan risiko paparan.^[2]

Metode pentakaktivan secara fisik meliputi pemanasan, penyinaran dengan cahaya ultraviolet (UV), radiasi gamma, serta melalui perubahan pH. Sementara itu, metode kimiawi mencakup penggunaan garam kaotropik berbasis guanidinium (senyawa yang mengganggu struktur biomolekul), deterjen seperti natrium dodesil sulfat (SDS), metanol, senyawa Tween, Triton X-100, β-propiolakton, hidrogen peroksida, berbagai aldehida seperti formaldehida, paraformaldehida, dan glutaraldehida, serta senyawa disulfida aromatik.^[2] Selain itu, terdapat pula kelompok khusus senyawa kimia yang bersifat fotoaktif, yaitu hanya bekerja setelah diaktifkan oleh cahaya, seperti psoralen, 1,5-iodonaftil azida, metilena biru, dan riboflavin.^[2]

Metode ini, yang dikembangkan oleh New York Blood Center, merupakan teknik inaktivasi virus yang paling banyak digunakan hingga saat ini. Penerapannya terutama dilakukan dalam industri plasma darah, digunakan oleh lebih dari 50 organisasi di seluruh dunia, termasuk Palang Merah Amerika (American Red Cross). Namun, metode ini hanya efektif terhadap virus yang memiliki selubung lipid.

Deterjen yang digunakan dalam proses ini mengganggu ikatan antarmolekul pada selubung lipid virus. Sebagian besar virus yang memiliki selubung lipid tidak dapat bertahan hidup tanpa lapisan tersebut sehingga akan hancur setelah terpapar deterjen. Sementara itu, virus lain mungkin tidak hancur sepenuhnya, tetapi kehilangan kemampuan untuk bereplikasi sehingga tidak lagi bersifat infeksius. Pelarut yang digunakan menciptakan kondisi yang mempercepat terjadinya reaksi antara selubung lipid virus dan deterjen. Deterjen yang paling umum digunakan dalam metode ini adalah Triton X-100.

Proses ini memiliki banyak keunggulan yang serupa dengan teknik penghilangan virus secara tradisional. Deterjen hanya memengaruhi lipid beserta turunannya sehingga protein tidak mengalami denaturasi. Metode ini mampu mencapai tingkat kematian virus hingga 100%, sementara peralatan yang dibutuhkan relatif sederhana dan mudah dioperasikan. Meskipun demikian, setelah proses inaktivasi selesai, diperlukan peralatan tambahan untuk memurnikan produk agar tidak terjadi kontaminasi pada tahapan proses berikutnya.

Perlakuan menggunakan pelarut dan deterjen (S/D) memanfaatkan reagen yang mudah diperoleh dan relatif murah. Namun, seluruh reagen tersebut harus dihilangkan dari produk sebelum didistribusikan sehingga diperlukan tahapan pemrosesan tambahan. Karena mekanisme kerjanya hanya menghilangkan atau merusak selubung lipid virus, metode ini tidak memberikan pengaruh terhadap virus yang tidak memiliki selubung lipid. Selain itu, larutan penyangga yang digunakan dalam proses ini tidak memiliki efek inaktivasi terhadap virus.

Pentakaktivan virus melalui pasteurisasi dapat sangat efektif apabila protein yang ingin dipertahankan memiliki ketahanan terhadap panas yang lebih tinggi dibandingkan virus yang menjadi kontaminan di dalam larutan. Keunggulan utama metode ini adalah peralatannya sederhana serta efektif terhadap virus yang memiliki maupun tidak memiliki selubung lipid.

Karena pasteurisasi dilakukan dengan meningkatkan suhu larutan hingga mencapai tingkat yang cukup untuk menyebabkan denaturasi virus, keberadaan selubung lipid tidak lagi memberikan perlindungan terhadap virus pada suhu tinggi tersebut. Namun demikian, beberapa jenis protein diketahui dapat bertindak sebagai penstabil termal, sehingga membantu virus tetap stabil terhadap panas. Di sisi lain, apabila protein target tidak tahan terhadap suhu tinggi, proses ini juga dapat menyebabkan denaturasi pada protein tersebut selain menginaktivasi virus. Proses inkubasi umumnya berlangsung selama 10 jam pada suhu 60 °C.

Sebagian virus akan mengalami denaturasi secara spontan ketika terpapar lingkungan dengan pH rendah. Seperti halnya pasteurisasi, metode ini efektif apabila protein target lebih tahan terhadap kondisi asam dibandingkan virus yang menjadi kontaminan.

Teknik ini efektif terhadap virus yang memiliki selubung lipid, sementara peralatan yang digunakan umumnya sederhana dan mudah dioperasikan. Akan tetapi, efektivitasnya terhadap virus tanpa selubung lipid jauh lebih rendah. Selain itu, metode ini sering kali memerlukan suhu yang lebih tinggi sehingga protein target harus mampu bertahan terhadap kombinasi pH rendah dan suhu tinggi. Sayangnya, banyak protein biologis tidak memiliki ketahanan tersebut. Inkubasi biasanya dilakukan pada pH 4 dengan lama proses antara 6 jam hingga 21 hari.

Inaktivasi menggunakan kondisi asam juga banyak diterapkan dalam proses pembuatan biofarmasi berbasis antibodi monoklonal. Proses ini dilakukan dengan menurunkan pH hingga mendekati atau di bawah 3,6, kemudian diinkubasi selama sedikitnya 30 menit pada suhu ruang.^[4]

Sinar ultraviolet (UV) dapat merusak DNA organisme hidup dengan menyebabkan terbentuknya dimer asam nukleat (ikatan abnormal antara dua basa nukleotida yang berdekatan). Pada organisme hidup, kerusakan tersebut umumnya tidak terlalu besar karena daya tembus sinar UV ke dalam jaringan relatif rendah. Namun, karena partikel virus berukuran sangat kecil, sinar UV dapat mencapai materi genetiknya secara langsung dan memicu pembentukan dimer tersebut. Setelah DNA mengalami dimerisasi, virus tidak lagi mampu menggandakan materi genetiknya sehingga kehilangan kemampuan untuk bereplikasi dan menyebar.

Kombinasi cahaya UV dan riboflavin telah terbukti efektif dalam mengurangi keberadaan patogen pada produk darah untuk transfusi.^[5] Riboflavin bersama sinar UV merusak asam nukleat pada virus, bakteri, parasit, serta sel darah putih dari donor, sehingga semuanya kehilangan kemampuan untuk bereplikasi dan menyebabkan penyakit.^[6][7]

Dalam banyak kasus, konsentrasi virus di dalam suatu sampel sangat rendah. Pada proses ekstraksi lainnya, keberadaan pengotor dalam jumlah kecil mungkin dapat diabaikan. Namun, karena virus merupakan pengotor yang bersifat infeksius, keberadaan satu partikel virus saja dapat cukup untuk menggagalkan seluruh rangkaian proses. Oleh karena itu, diperlukan metode khusus untuk menentukan teknik penghilangan atau inaktivasi yang paling sesuai bagi jenis virus tertentu yang akan dipisahkan dari suatu larutan.

Studi spiking dikembangkan secara khusus untuk tujuan tersebut. Studi ini dilakukan untuk mengevaluasi kemungkinan metode penghilangan maupun pentakaktivan virus yang paling efektif. Hasilnya dinyatakan dalam bentuk data kuantitatif yang kemudian digunakan oleh para peneliti untuk menilai apakah suatu proses tertentu sesuai untuk menghilangkan atau menginaktivasi jenis virus yang diteliti dari larutan yang digunakan.

Berbagai percobaan menunjukkan bahwa peningkatan jumlah virus (atau tingkat aktivitas virus) dalam suatu sampel hingga 10⁴ atau 10⁵ kali dari konsentrasi awal hanya akan mengubah rasio penghilangan atau inaktivasi virus sebesar satu orde magnitudo (kelipatan sepuluh).

Berdasarkan temuan tersebut, dikembangkanlah studi spiking, yaitu prosedur yang dilakukan dengan menambahkan virus secara sengaja ke dalam sampel sehingga jumlah atau tingkat aktivitasnya meningkat hingga 10⁴ atau 10⁵ kali dibandingkan kondisi semula. Sampel dengan konsentrasi virus yang telah ditingkatkan ini kemudian diproses melalui rangkaian pemurnian yang akan dievaluasi. Jumlah atau tingkat aktivitas virus diukur sebelum dan sesudah proses berlangsung, lalu digunakan untuk menghitung faktor reduksi (Reduction Factor).

Faktor reduksi (RF) untuk suatu tahap penghilangan atau inaktivasi virus dihitung menggunakan persamaan berikut:^[8]

${\displaystyle RF_{\text{tahap}}=\log _{10}\left({\frac {V_{1}\times T_{1}}{V_{2}\times T_{2}}}\right)}$

dengan:

• ${\displaystyle V_{1}}$ = volume bahan baku yang telah ditambahkan virus (spiked feedstock) sebelum tahap penghilangan virus;
• ${\displaystyle T_{1}}$ = virus pada bahan baku tersebut sebelum tahap penghilangan virus;
• ${\displaystyle V_{2}}$ = volume bahan setelah melalui tahap penghilangan virus; dan
• ${\displaystyle T_{2}}$ = konsentrasi virus pada bahan setelah melalui tahap penghilangan virus.

Besarnya faktor reduksi yang diperlukan dalam suatu rangkaian proses bergantung pada berbagai faktor, antara lain:

• perkiraan konsentrasi awal virus dalam bahan;
• jenis produk yang sedang dimurnikan;
• dosis infeksius virus (khususnya untuk penggunaan in vivo);
• apakah inaktivasi dapat menjadi alternatif yang memadai dibandingkan penghilangan virus secara menyeluruh;
• kemampuan dan fasilitas laboratorium yang melakukan pengujian; serta
• tingkat kesulitan relatif dari metode inaktivasi atau penghilangan virus yang dipilih.