Ottenne due candidature per l'Academy Awards, quattro per il Golden Globe e vinse un Tony Award e un Emmy Award come miglior attrice. È conosciuta principalmente per i suoi ruoli nelle commedie cinematografiche americane.
Nata a Boston, Massachusetts, dalla diciassettenne Paula Goldberg e da Bernard Wolfson, Madeline Kahn aveva soltanto due anni quando i suoi genitori divorziarono al ritorno del padre dal fronte della seconda guerra mondiale. Dopo il divorzio, sua madre e lei si trasferirono a New York. Già mentre frequentava le scuole inferiori si appassionò alla recitazione, partecipando a numerose produzioni scolastiche, sempre supportata dalla madre. Nel 1960 si diplomò alla Martin Van Buren High School del Queens, e successivamente si iscrisse alla Hofstra University, dove si laureò nel 1964 dopo aver studiato arte drammatica e musica.
Prediligendo ruoli comici piuttosto che drammatici, la sua carriera continuò anche negli anni ottanta, periodo in cui fece numerose partecipazioni televisive e ottenne un proprio live show, che però durò solo due stagioni a causa della scarsa audience. Tornò al teatro negli anni novanta, vincendo il Tony Award nel 1993 per la sua interpretazione in The Sisters Rosensweig. Parallelamente continuò la sua attività cinematografica prestando la voce in diversi lavori. Nel 1999 partecipò al suo ultimo film, Judy Berlin, per una casa indipendente.
All'inizio del 1999 le fu diagnosticato un cancro alle ovaie. Nonostante fosse in cura, continuò a lavorare e apparve anche nella serie televisiva Cosby, dove interpretò la parte di Pauline Fox. Mentre la malattia progrediva rapidamente, nell'ottobre 1999 l'attrice sposò il suo compagno di vita, John Hansbury. Morì il 3 dicembre 1999 a New York.