В сентябре 1548 года Максимилиан женился на своей кузине Марии, дочери Карла V, и с 1548 по 1550 годы был наместником императора в Испании. В декабре 1550 году он вернулся в Германию, чтобы принять участие в обсуждении судьбы императорского престола. Карл V желал, чтобы его сын Филипп (впоследствии король Испании) стал его преемником, однако его брат Фердинанд, правивший династическими землями Габсбургов, тоже хотел получить императорский титул. Компромисс был достигнут: Филипп был объявлен наследником Фердинанда. Между двумя ветвями Габсбургов были весьма натянутые отношения, из-за которых болезнь Максимилиана в 1552 году приписывали отравлению в интересах его кузена Филиппа.
Примерно в то же время Максимилиан поселился в Вене и стал править австрийскими владениями и оборонять их от турок. Ещё в раннем возрасте Максимилиан попал под влияние протестантизма, он поддерживал дружеские отношения с протестантскими правителями и близко общался с придворным священником-лютеранином. Его отец, став императором в 1558 году, пообещал папе Павлу IV, что его сын не взойдёт на императорский престол, если покинет католическую церковь. Таким образом, Максимилиан формально оставался католиком, хотя до конца жизни придерживался протестантских взглядов.
Став императором, Максимилиан вынужден был разбираться с религиозным расколом в своих землях. Будучи веротерпимым монархом, он старался соблюсти баланс и часто выступал посредником между католиками и протестантами. В 1568 году после очередной войны с Османской империей Максимилиан заключил с султаном Селимом II мирный договор с выплатой туркам дани в течение 8 лет.
Отношения между Максимилианом и Филиппом Испанским со временем наладились. Смерть испанского инфанта Карлоса в 1568 году открывала для Максимилиана или его сыновей путь к наследованию испанского престола. В 1570 году дочь императора Анна стала четвёртой женой его кузена Филиппа II. Также Максимилиан без особого успеха заступался за перешедшие в протестантизм Нидерланды, которые Филипп пытался покорить огнём и мечом. В 1575 году группа польских и литовских магнатов предложила Максимилиана в качестве кандидата на трон Польши, однако он не имел достаточной популярности и королём избрали трансильванского князя Стефана Батория.
Максимилиан скончался 12 октября 1576 года в Регенсбурге. Перед смертью он отказался от последнего причастия. Император был похоронен в соборе Святого Вита в Праге. Трон Максимилиана перешёл его сыну Рудольфу, а позже императором также стал его сын Матвей.